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成(cheng)功的(de)IHC/ICC實(shi)驗(yan)操作指南(八)

實(shi)驗(yan)的(de)每一小步,都是決定結果的(de)一大步。本期將為大家講解抗原修復的(de)重要性,喜(xi)歡的(de)話就(jiu)繼(ji)續往下看吧(ba)!

盡管固定對于組織形態(tai)的(de)保(bao)留是必不可少的(de),但這一過程對IHC/ICC檢測也有不良影響。固定可能改變蛋白的(de)生化特性,如目的(de)表位被掩蓋不再與一抗結合。表位的(de)掩蓋可能是由表位內氨基酸的(de)交聯、表位huan)蚋澆壞閿胛薰仉tai)段(duan)的(de)交聯、表位構象的(de)改變或抗原靜電荷(he)的(de)改變引起的(de)。抗原修復指的(de)是任何可以逆(ni)轉表位掩蓋和(he)恢復表位-抗體結合的(de)技術(shu)。

抗原修復技術(shu)

抗原修復的(de)需要取決于多個(ge)變量,包括但不限于,目的(de)抗原、所使(shi)用的(de)抗體、組織類型(xing),以及固定方(fang)法(fa)和(he)持續時(shi)間(jian)。多克隆(long)抗體能識別多個(ge)表位,因(yin)此即使(shi)不進行(xing)抗原修復,它(ta)們也比(bi)單克隆(long)抗體更(geng)有可能檢測到特定抗原。

目前(qian)有多種技術(shu)可恢復表位的(de)免疫反應性yu)<虻?de)方(fang)法(fa)有改變抗體稀釋液的(de)ρH或陽離子you) 齲 飪贍苡跋煒固逵氡砦壞de)親和(he)力。對于部分掩蓋的(de)表位,在開(kai)始抗原修復之前(qian)可以先試試改變一抗的(de)孵育條(tiao)件。不過,這一步也需要抗體濃度、孵育時(shi)間(jian)和(he)溫度的(de)進一步優(you)化。在討論抗體修復方(fang)法(fa)時(shi)bao) 際shu)通常分為兩大類,蛋白黴誘導(dao)的(de)表位修復(PIER)和(he)熱(re)誘導(dao)的(de)表位修復(HIER)。一旦優(you)化好,抗原修復的(de)影響可以是明顯的(de)。

蛋白黴誘導(dao)的(de)表位修復(PIER)

在PIER方(fang)法(fa)中,蛋白黴K、胰蛋白黴和(he)胃蛋白黴等都曾(zeng)成(cheng)功恢復抗體與表位的(de)結合。人(ren)們認為作用機制是切割了可能遮(zhe)蓋表位的(de) (tai)段(duan)。PIER的(de)缺點在于恢復免疫反應性的(de)成(cheng)功率shi)di),且有可能破壞組織形態(tai)和(he)目的(de)抗原。

熱(re)誘導(dao)的(de)表位修復(HIER)

HIER被認為能逆(ni)轉一些(xie)交聯,並(bing)實(shi)現(xian)表位二級(ji)或三(san)級(ji)結構的(de)重建。實(shi)驗(yan)方(fang)案必須(xu)針(zhen)對每種組織、固定方(fang)法(fa)和(he)待研究抗原進行(xing)優(you)化。總的(de)來說(shuo),HIER的(de)成(cheng)功率shi)IER要高得多。

HIER可利用微波爐、高壓鍋、蒸屜、高壓滅菌鍋或水(shui)浴(yu)開(kai)展。在HIER實(shi)驗(yan)中,微波爐是越(yue)來越(yue)流行(xing)的(de)設備(bei)。這些(xie)方(fang)案大多加熱(re)5分鐘,然後(hou)更(geng)換(huan)緩沖液。對于所有HIER方(fang)法(fa),在開(kai)始IHC/ICC孵育之前(qian)必須(xu)讓(rang)玻片冷卻(que)。HIER對時(shi)間(jian)、溫度、緩沖液和(he)pH特別敏(min)感,最佳方(fang)法(fa)必須(xu)根據經驗(yan)確定。

優(you)化和(he)局限性

抗原修復可能需要加強樣品與玻片或蓋玻片的(de)附著。此外,此技術(shu)對于冰凍組織切片和(he)醇固定切片通常過于劇烈(lie)。對于每種設備(bei),時(shi)間(jian)、溫度和(he)pH必須(xu)經過優(you)化(如92-95°C水(shui)浴(yu)要5-10分鐘,而120°C高壓鍋要1-5分鐘)。為了優(you)化抗原修復,必須(xu)開(kai)展預實(shi)驗(yan),使(shi)用時(shi)間(jian)、溫度和(he)pH的(de)各種組合。在使(shi)用抗原修復方(fang)法(fa)時(shi)bao) κ賈湛kao)慮到假陽性的(de)可能性yu)Jshi)驗(yan)應當包含(han)對照,以證明特異(yi)的(de)抗體結合,因(yin)為染色常受到實(shi)驗(yan)中多個(ge)變量的(de)影響。

R&D Systems提(ti)供了一些(xie)試劑,可改善組織抗原檢測,並(bing)增強免疫反應性yu)T誄chu)次優(you)化時(shi)bao) 芯咳ren)員可比(bi)較經中xing)H7.0通用抗體修復液(貨號CTS015)處理的(de)樣品和(he)未(wei)經過抗原修復的(de)同一組織樣品。之後(hou)可能需要使(shi)用酸性或堿(jian)性的(de)抗原修復液,這取決于組織。在R&D Systems,我們發(fa)現(xian)堿(jian)性抗原修復液(貨號CTS013)的(de)處理通常很成(cheng)功。我們也提(ti)供酸性(貨號CTS014)以及試用裝(zhuang)(貨號CTS016)的(de)抗原修復液。與中xing)勻芤合啾bi),酸性和(he)堿(jian)性抗原修復液更(geng)可能影響組織形態(tai)。

以上文字(zi)和(he)圖片來源(yuan)于Bio-techne。

 

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