EN

IHC實驗疑難解析大匯總

本ju)芐”嘟 lai)IHC系列培訓(xun)的(de)最後(hou)一講(jiang),IHC實驗中各種常見問題的(de)原因(yin)分析和解決(jue)方案(an)。希望通過本次(ci)課程,您(nin)可以了解到 IHC 實驗中出現異(yi)常情況時您(nin)可采取(qu)的(de)措施。

一、切片無染(ran)色(se) 

IHC 中可能遇到的(de)一個主(zhu)要問題是無染(ran)色(se)。出現這一問題的(de)原因(yin)主(zhu)要有(you)三個︰

  • 蛋白表達量低(di)/無表達 

  • 樣本ju)票bei)不良 

  • 試劑/方案(an)問題 

1、表達量低(di)/無表達

  • 確(que)定目標蛋白的(de)表達量,用(yong)工(gong)具查詢,Uniport官網(wang): https://www.uniprot.org/

  • 了解目標蛋白表達的(de)種屬特異(yi)性和組(zu)織特異(yi)性,有(you)時候目標蛋白在一些常見種屬(如︰人)有(you)表達,並(bing)不表示在其他種屬上也(ye)有(you)表達。

解決(jue)方案(an)︰

  • 在實驗前查詢文獻,確(que)定您(nin)待檢測的(de)目標種屬和組(zu)織的(de)表達量情況

  • http://www.proteinatlas.org/,在這個網(wang)站(zhan)上會提供(gong)人體組(zu)織的(de)不同蛋白RNA表達數(shu)據和IHC數(shu)據,可以作為參考;

  • 在實驗方案(an)中添加(jia)陽(yang)性對照組(zu)織樣本,驗證實驗體系的(de)正確(que)性;

  • 陽(yang)性對照的(de)細胞系,一些情況下,可以選擇(ze)確(que)定會表達目標蛋白的(de)細胞系作為陽(yang)性對照;

  • 質量優良的(de)抗體說明書上會給出建議的(de)陽(yang)性對照樣本,可以作為參考。

圖1、人體不同組(zu)織的(de)表達分布,來(lai)源︰proteinatlas官網(wang)

2、樣本ju)票bei)不良

  • 固定步(bu)驟︰過度固定組(zu)織或固定時間不夠;固定時使(shi)用(yong)福爾馬林(lin)和多聚甲醛固定劑可能會遮蔽抗體識別的(de)表位。

解決(jue)方案(an)︰

  • 用(yong)不同的(de)抗原修(xiu)復(fu)方法(fa)暴(bao)露表位(用(yong) pH 6 或 pH 9 緩(huan)沖液(ye)熱修(xiu)復(fu)、黴修(xiu)復(fu)等(deng))。

  • 如果過度固定,則需要縮短固定時間。

  • 可能脫蠟不充分

解決(jue)方案(an)︰

  • 延長脫蠟時間,且需要使(shi)用(yong)新鮮二甲苯

 

圖2 、不同修(xiu)復(fu)液(ye)對染(ran)色(se)效(xiao)果的(de)影響

3、試劑/方案(an)問題

  • 一抗問題︰

  • 濃度太(tai)低(di)︰按(an)照說明書上的(de)建議,梯度稀釋抗體後(hou)實驗,選擇(ze)合適的(de)濃度qu)/p>

  • 孵育時間不夠︰嘗試在 4°C 孵育更(geng)長時間(例如過夜)。

  • 抗體可能不適用(yong)于IHC應(ying)用(yong),因(yin)為其可能無法(fa)識別蛋白質的(de)天(tian)然(3D)構象。

檢查抗體數(shu)據表,查看其是否在 IHC 中得到了驗證及其 IHC 的(de)類型(石蠟切片、冰凍切片等(deng))。抗體在免(mian)疫細胞化學(ICC)或免(mian)疫沉澱(IP)中的(de)成(cheng)功(gong)使(shi)用(yong)暗示了抗體能夠識別蛋白質的(de)天(tian)然構象。  

  • 二抗問題︰

  • 使(shi)用(yong)的(de)二抗為抗一抗宿主(zhu)的(de)抗體(例如,如果在兔中生產一抗,則使(shi)用(yong)抗兔二抗)。檢查一抗的(de)亞型是否被二抗識別。

  • 用(yong)其他蛋白的(de)一抗檢測二抗效(xiao)果,確(que)保二抗正常使(shi)用(yong)。

二、高(gao)背景

免(mian)疫組(zu)化染(ran)色(se)之(zhi)後(hou)的(de)高(gao)背景是困(kun)擾(rao)很多實驗者(zhe)的(de)常見現象,如果您(nin)遇到類似問題,可以對照下表的(de)分析,嘗試相應(ying)的(de)解決(jue)方案(an)。

可能的(de)問題原因(yin)

解決(jue)方案(an)

沒有(you)封閉或封閉不足(zu)

  • 增加(jia)封閉時間,考慮更(geng)換封閉劑。如果使(shi)用(yong)血清,Abcam 推薦(jian)使(shi)用(yong)二抗種屬來(lai)源的(de)正常血清(10%)封閉 1 小時。

  • 試用(yong)商業化封閉緩(huan)沖液(ye)。

  • 另一種選擇(ze)是嘗試預吸(xi)附二抗。

  •  

一抗濃度可能過高(gao)

滴定抗體至最佳濃度,進一步(bu)稀釋抗體並(bing)在 4℃ 孵育(緩(huan)慢孵育,但(dan)有(you)針對性地(di)結(jie)合效(xiao)果最佳)。

 

孵育溫度可能過高(gao)

  • 4°C 下孵育切片。

  •  

二抗可能是非特異(yi)性結(jie)合

  • 使(shi)用(yong)不加(jia)一抗只加(jia)二抗的(de)對照。

  • 如果您(nin)只看到二抗非特異(yi)性染(ran)色(se),請更(geng)換二抗,或者(zhe)使(shi)用(yong)預吸(xi)附二抗。

  •  

組(zu)織沖洗不充分,仍殘留(liu)固定劑

  • 所有(you)步(bu)驟之(zhi)間用(yong) PBS 充分沖洗。

  •  

內源性過氧(yang)化物黴具有(you)活性

  • 用(yong)黴抑制劑,使(shi)用(yong)左旋咪唑 (2 mM) 抑制堿(jian)性磷酸黴,或用(yong)H2O2(0.3% v/v) 抑制過氧(yang)化物黴。

  •  

檢測系di)tong)是熒光顯微鏡,固定過程引(yin)起自發熒光

  • 福爾馬林(lin)/PFA 通常在綠色(se)光譜中出現自發熒光,因(yin)此可試用(yong)在紅(hong)光譜內的(de)熒光基(ji)團。

  • 如果您(nin)有(you)紅(hong)外檢測系di)tong),可以使(shi)用(yong)紅(hong)外範(fan)圍內的(de)熒光基(ji)團。

  •  

信號擴增過多(間接(jie)技術)

  • 減少擴增孵育時間,稀釋二抗或擴增試劑盒試劑。

  •  

應(ying)用(yong)過多底物(黴檢測)

  • 更(geng)大倍(bei)數(shu)稀釋底物,減少底物孵育時間。

  •  

色(se)原與組(zu)織樣本ju)BS 反應(ying)(黴檢測)

  • 在與底物孵育前使(shi)用(yong) Tris 緩(huan)沖液(ye)清洗切片。

  •  

通透破壞細胞膜並(bing)去除(chu)膜蛋白(膜蛋白)

  • 更(geng)換通透劑(如用(yong) Tween® 20 代(dai)替 Triton™ X-100)

  • 使(shi)用(yong)不huan) ㄍ訃戀de)緩(huan)沖液(ye)。

三、非特異(yi)性染(ran)色(se)

非特異(yi)性染(ran)色(se)也(ye)是小編在日常工(gong)作中被問到頻率較高(gao)的(de)問題,希望下面(mian)這些建議一次(ci)性解答您(nin)的(de)各種疑問。

  • 一抗/二抗濃度可能過高(gao)。

    • 嘗試降低(di)抗體濃度和/或縮短孵育期。可以與不表達靶蛋白的(de)陰性組(zu)織進行比較。

  • 內源性過氧(yang)化物黴具有(you)活性。

    • 用(yong)黴抑制劑,使(shi)用(yong)左旋咪唑 (2 mM) 抑制堿(jian)性磷酸黴,或用(yong) H2O2 (0.3% v/v) 抑制過氧(yang)化物黴。

  • 一抗是抗染(ran)色(se)組(zu)織來(lai)源ci)鎦值de)抗體(例如在小鼠組(zu)織樣本上使(shi)用(yong)小鼠一抗)。當應(ying)用(yong)二抗時,其與組(zu)織樣本結(jie)合,因(yin)為其為抗該(gai)種屬抗體。

    • 使(shi)用(yong)的(de)一抗為針對與您(nin)組(zu)織來(lai)源ci)鎦植煌 鎦值de)抗體。

    • 使(shi)用(yong)商業化試劑盒(例如,mouse on mouse 試劑盒︰ab127055)。

  • 切片/細胞已經(jing)干燥。

    • 將切片/細胞保持在高(gao)濕(shi)度下以防變干。

總結(jie)

您(nin)現在應(ying)該(gai)已經(jing)完全(quan)了解了 IHC 的(de)常見疑難問題知(zhi)識,包括(kuo)︰

1、切片無染(ran)色(se)的(de)原因(yin)及解決(jue)方法(fa);

2、遇到高(gao)背景染(ran)色(se)結(jie)果時的(de)處理方案(an);

3、排除(chu)非特異(yi)性染(ran)色(se)時的(de)做法(fa)。

希望您(nin)通過這次(ci)系列培訓(xun)了解所有(you)相關實驗知(zhi)識,使(shi)您(nin)可以順利完成(cheng)所有(you)實驗。IHC 的(de)培訓(xun)到這里就結(jie)束了。請務(wu)必把這些信息(xi)保存(cun)在安全(quan)的(de)地(di)方,以yuan)溉蘸hou)參考。

 

本文內容(rong)來(lai)源于abcam官網(wang)。

中源生物是Abcam公(gong)司授權的(de)一級(ji)代(dai)理商

如有(you)相關問題請撥打免(mian)費服務(wu)電話咨(zi)詢

400-8100-881

如您(nin)對我們的(de)服務(wu)有(you)任何的(de)意見和建議請發至如下郵箱

service@sinozhongyuan.com

附件︰
 
手机彩票代理 | 下一页